农业技术 | 高致病性禽流感的主要诊断技术

禽流感是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽类感染为主的人畜共患病。禽流感病毒的外膜血凝素HA有16种亚型（H1-H16），神经氨酸酶NA共有9种亚型（N1-N9），据此可分为几百个亚型。禽流感分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和非致病性禽流感。其中低致病禽流感和无致病性禽流感在生产中危害很小，高致病性禽流感不仅感染鸡、鸭等禽类，也可能感染人，导致人死亡。

笔者结合多年实践经验，分别从流行病学、临床症状、病理学诊断、实验室诊断等四个角度来分析诊断高致病性禽流感，以期为科学诊断高致病性禽流感提供一个参考。

1.流行病学。①传播源。病死禽及带病禽类的血液、组织、分泌物和排泄物，以及被其污染的饮水、寝具、空气、笼具、车辆、昆虫、种蛋等都会将病毒四处传播。

②传播途径。水平传播，主要为呼吸道和消化道传播；垂直传播，经种蛋传播。值得注意的是，候鸟的迁徙可以携带病毒从一个地方传播到另外一个地方。

③易感动物。禽流感可以感染多种禽类。家禽中以火鸡最为敏感，鸡、雉鸡、鹌鹑、鸵鸟、鸭和鹅等均可受禽流感的感染而死亡。

2.临床症状。无症状突然死亡，或发病后急剧死亡；脚麟出血；鸡冠出血或发绀，面部及眼部浮肿；鸭、鹅等禽类出现神经及腹泻等症状，有时出现角膜炎症，甚至失明；产蛋率下降。

3.病理学诊断。①消化道、呼吸道黏膜广泛出血、充血；腺胃黏液增多，可见腺胃乳头出血，腺胃和肌胃之间交界处可见带状出血；

②冠及腹部脂肪出血。卵管的中部可见乳白色分泌物或凝块；卵泡充血、出血、萎缩、破裂，有的可见卵黄性腹膜炎；

③脑部出现坏死灶、血管周围淋巴细胞管套、神经胶质灶、血管增生等病变；胰腺和心肌组织局灶性坏死。

4.主要诊断技术分析。高致病性禽流感易与新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、传染性法氏囊病等疫病相混淆，所以其确诊必须依赖实验室诊断。

①病毒分离与鉴定。从死禽采集气管、脾、肺、肝、肾、脑等组织样品，活禽病料应包括气管或泄殖腔拭子，小珍禽采集新鲜粪便，经处理后制成悬液。经尿囊腔接种SPF鸡胚，孵化后记录鸡胚死亡情况。无菌收取死胚和存活鸡胚尿囊液。若尿囊液中无血凝活性或者血凝价很低，经继代培养仍为阴性，则认为病毒分离阴性；若尿囊液有血凝活性，则从具有血凝活性的鸡胚中取出绒毛尿囊膜，经处理后，用禽流感标准阳性血清做琼脂免疫扩散试验进行型特异性鉴定。若被检样品与标准阳性血清之间出现清晰的沉淀线即可判定样品中含有A型禽流感病毒。

由此可见，这种方法周期长、成本高，并且需要在生物安全实验室或国家指定研究机构进行。

②酶联免疫吸附测定（Elisa试验）。Elisa试验主要包括间接法、夹心法、竞争法。主要利用抗原抗体的特异性反应，然后酶标记物标记催化底物反应显色，根据显色颜色深浅来定量病毒含量的多少。一般用于检测禽类体中的抗体水平。

这种方法的优点是：特异、灵敏、快速、简便，可迅速检测大量样品，使用仪器设备少，利于基层操作，有效，实用。但是，在抗原、抗体、信号放大系统、干扰因素去除有不尽完善的方面。

③血凝与血凝抑制试验。病毒表面的血凝素能与红细胞球结合，称作病毒的凝集作用。当加入与抗原相特异性的抗体时，这种凝集作用就被抑制，这就是血凝抑制的原理。不仅可以用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定,更可用于禽群免疫状态评价。

这种方法设备要求简单，适用于基层兽医实验室检测。但缺点是操作步骤多，主观因素强，容易判断失误。

④神经氨酸酶抑制试验（NIT）。一般用于NA亚型的分类，也可以用于血清中NI抗体的定性测定。它的原理是：NA与胎球蛋白作用释放出的唾液酸、亚砷酸钠溶液可以终止唾液酸酶的活性，硫代巴比妥酸溶液与游离的唾液酸以一定比例结合可以产生粉红色。粉红色表明血清无抑制作用，无色者表明血清有抑制作用，由此判定亚型。

⑤分子生物学诊断技术（PCR)。PCR是通过体外酶的合成作用，形成具有特异性DNA片段的一种新技术。它的基本原理涉及到三个基础反应程序：变性、退火及延伸。这三个反应多次循环交替，可将DNA片段扩增到百万倍。此后可以运用序列分析或探针杂交手段检测分析基因的扩增产物。

PCR的优点是灵敏性好、特异性强。缺点是依赖特定的设备、良好的实验条件和高素质的技术人员，难以在疫区和基层推广应用。

⑥胶体金免疫测定。检测样本滴加到检测板上的样品孔中，样品中的禽流感抗原会和胶体金标记的单抗发生反应，形成抗原抗体复合物，并沿着试纸条流向NC膜的另一端。当复合物流到膜上的T区时，固定在膜上的特异性单抗捕获该复合物，形成一条可见的T线，没结合的复合物流过T区，被C区的二抗捕获形成质控线C线。如果样本中含有病毒，检测线T和质控线C线同时显色，结果为阳性。反之，检测线T不显色，质控线C线显色，结果为阴性。

胶体金免疫法具有以下优点：观察结果直观，不需要任何仪器；

灵敏度高，速度快，一个样品检测时间不超过20分钟。

但是，胶体金免疫测试的灵敏性和特异性有待进一步验证。在实际工作中，还有更多的实验室检测方法有待补充。

高致病性禽流感危害巨大，严重影响畜牧业的发展和人类的健康。以上方法为高致病性禽流感的防治提供了一定的技术支持。